Identification of Crude and Purified Bacterial Proteinases by Agar Gel Diffusion and Agar Gel Electrophoretic Procedures

Summary

The double diffusion technique, immunoelectrophoresis, the zymogram technique for proteinases and the casein precipitation inhibition test (GPI-test) were employed for identification of specific bacterial proteinases produced by Aeromonas liquefaciens, Aeromonas salmonicida and Pseudomonas aeruginosa. The precipitation lines observed with both homologous and heterologous proteinase-antiproteinase systems in the double diffusion technique and in immunoelectrophoresis, supported in certain respects previous findings regarding the Aeromonas proteinases, but the reactions were not sufficiently specific to give a confirmation of the real relationships between the proteinases. It is concluded that the double diffusion technique and Immunoelectrophoresis are less specific than the GPI-test for the identification of both crude, and purified, proteinase-antiproteinase systems. The zymograms, in combination with the immunoelectrophoretic patterns, could under certain conditions give useful information about the identity of lines representing the proteinase-antiproteinase precipitates in the double diffusion systems. The number of precipitation lines caused by the crude proteinase solutions in Immunoelectrophoresis decreased during storage of the crude antigens, and the solutions could finally behave like the solution of purified antigen.

It was shown that the GPI-test was at least 66 to 225 times more sensitive with respect to antigens, and two to three times more sensitive with respect to antisera than the double diffusion technique, for the three systems examined. This is of methodological importance, as high functional activity may be present in a proteinase solution although the structural conditions are unsuitable or the amount of enzyme protein is too small to allow the development of any precipitation lines in the double diffusion technique.

Sammendrag

Dobbeldiffusjonsteknikken, immunoelektroforese, zymogramteknikken for proteinaser og kaseinpresipitasjons-inhibisjonstesten (CPI-testen) ble anvendt for identifikasjon av spesifikke bakterielle proteinaser produsert av Aeromonas liquefaciens, Aeromonas salmonicida og Pseudomonas aeruginosa. Presipitasjonslinjene som ble observert både med homologe og heterologe proteinase-antiproteinasesystemer ved dobbeldiffusjonsteknikken og immunoelektroforese, understøttet i visse henseender de tidligere funn med hensyn til Aeromonasproteinasene, men reaksjonene var ikke tilstrekkelig spesifikke til å stadfeste de virkelige relasjonene mellom proteinasene. Det ble konkludert med at dobbeldiffusjonsteknikken og immunoelektroforese er mindre spesifikke enn GPI-testen for identifikasjon av både urensede og rensede proteinase-antiproteinasesystemer. Zymogrammene kunne under visse omstendigheter gi verdifulle opplysninger om identiteten til linjer som representerte proteinase-antiproteinase-presipitater i dobbeldiffusjonsystemene, når de ble brukt i kombinasjon med de immunoelektroforetiske mønstre. Antallet av presipitasjonslinjer forårsaket av de urensede proteinaseløsningene ved immunoelektroforese, avtok ved lagring av de urensede antigenene, og løsningene oppførte seg til slutt som løsningen av det rensede antigen.

Det ble vist at GPI-testen var minst 66 til 225 ganger mer sensitiv med hensyn til antigenene, og to til tre ganger mer sensitiv med hensyn til antisera enn dobbeldiffusjonsteknikken for de tre systemene som ble undersøkt. Dette er av metodologisk betydning, da høy funksjonell aktivitet kan være til stede i en proteinaseløsning selv om de strukturelle betingelser ikke er passende eller mengden av enzymprotein er for liten til å forårsake noen presipitasjonslinjer ved dobbeldiffusjonsteknikken.