The Estimation of Numbers of Coli Bacteria in Foods by Means of A Deep Agar Tube Technique with A Modified Violet Red Bile Agar

Summary

The author has investigated the possibilities of substituting the agar plate technique for a deep agar tube technique in estimating numbers of ooliform bacteria in foods. Especially when water bath incubation at 44°C is used for selective counting of E. coli I a tube technique would seem to offer considerable practical advantages over the ordinary Petri dish plate technique. The medium selected for the purpose is Violet Red Bile Agar. However, in order to be able to cultivate ooliform bacteria in VRB-deep agar tubes the formation of gas from fermentation of lactose must be suppressed. To achieve anaerogenic growth of ooliform bacteria the author has utilized the existing knowledge of the inhibitory effect of nitrate- and nitrite ions upon the formic acid hydrogenlyase enzyme which catalyses the decomposition by coliforms of formic acid into hydrogen and carbon dioxide. Nitrate was found preferrable to nitrite because of less inhibitory effect. The optimal concentration of nitrate in VRB Agar was determined to 0.5 % NaNO₃. Flat Miller-Prickett-tubes with an inlaid white enamel glass plate were found to facilitate counting. To obtain well developed colonies with a typical zone of precipitation the agar contents of the medium was reduced to 0.9 per cent. Two series of comparative coli counts with the modified VRB-Nitrate agar in deep agar tubes against ordinary VRB-Agar in Petri dishes at 37° C and 44°C showed on the whole no statistically valid differences.

The problem of small retarded colonies appearing in tube cultures and plate cultures as well, mostly when seeded with raw milk, was investigated. All of 108 such strains except two could be identified as members of the ooliform group. The selectivity of the medium was tested by plating a variety of non-ooliform organisms. Only a few strains of fecal streptococci, Proteus, Aloaligenes and Pseudomonas were capable of scanty growth, and in no instance the resulting colonies could be mistaken for colonies of ooliform bacteria.

Zusammenfassung

Der Verfasser untersuchte die Möglichkeiten, die Agarplattenmethode durch eine Hochagartechnik zur Zählung coliformer Bakterien in Lebensmitteln zu ersetzen. Besonders bei einer Inkubation im Wasserbad bei 44° C scheint die Hochagartechnik praktische Vorteile gegenüber dem gewöhnlichen Gebrauch von Petrischalen zu bieten. Zu den Untersuchungen wurde Rot-Violett-Galleagar (R.V.G.-Agar) angewandt. Um eine Zählung coliformer Bakterien in Hochagarröhren mit R.V.G.-Agar vornehmen zu können, muss die bei der Vergärung von Laktose entstehende Gasentwicklung verhindert werden; es wird festgestellt, dass man —auf Grund der Kenntnis bei flüssigen Kulturen — auch in festem Substrat die hemmende Wirkung der Nitrat- und Nitritionen auf das Ameisensäure-Hydrogenlyaseenzym ausnutzen kann, das die Spaltung der coliformen Bakterien von Ameisensäure in Sauerstoff und Kohlendioxyd katalysiert. Es zeigte sich, dass Nitrationen den Nitritionen vorzuziehen waren, und als optimale Nitratkonzentration wurde 0,5 %o NaNO₃ bestimmt. Ferner erwies es sich, dass flache Miller-Prickett-Tuben mit eingelegter weisser Emailglasplatte die Koloniezählung wesentlich erleichterten. Zwecks Erzielung gutentwickelter Kolonien mit einer typischen Präzipitatzone wurde der Agarinhalt des Mediums auf 0,9 % reduziert. Zwei Aussaatreihen zur vergleichenden Colizählung in modifizierten R.V.G.-Nitrathochagar gegenüber gewöhnlichem R.V.G.-Agar in Petrischalen sowohl bei 37° als auch 44° C zeigten im grossen ganzen keinen statistisch sicheren Unterschied.

Bei der Züchtung besonders aus roher Milch wurde sowohl in den Hochagarröhren als auch im Plattenmedium eine Reihe sehr kleiner und scharf begrenzter Kolonien wahrgenommen. 108 von diesen Stämmen — mit Ausnahme von 2 Stämmen — Hessen sich in die Gruppe conformer Bakterien einreihen. Im Hinblick auf die Untersuchung der selektiven Eigenschaften des R.V.G.-Agars wurde die Aussaat einer Reihe von nichtcoliformen Mikroorganismen ausgeführt. Hierbei zeigte es sich, dass nur einige wenige Streptokokkenstämme (zur Faecalis-Gruppe gehörig) sowie Proteus, Alcaligenes und Pseudomonas imstande waren, in diesem Medium zu wachsen, jedoch in keinem Falle mit Kolonien, die mit Golikolonien verwechselt werden konnten.

Resumé

Forfatteren har undersøgt mulighederne for at erstatte agarplademetoden med en høj agarteknik til tælling af coliforme bakterier i levnedsmidler. Specielt når inkubationen sker i vandbad ved 44° C må høj agarteknikken antages at byde på praktiske fordele frem for anvendelse af almindelige petriskåle. Til undersøgelserne er anvendt Rødviolet-galdeagar (R.V.G.-agar). For at kunne foretage tælling af coliforme bakterier i høj agarrør med R.V.G.-agar må luftudviklingen, fremkommet ved bakteriernes forgæring af laktose, hindres, og det konstateres, at man — lige som det er kendt for flydende kulturers vedkommende — også i fast substrat kan udnytte nitrat- og nitritioners hemmende virkning på myresyrehydrogenlyaseenzymet, som katalyserer de coliforme bakteriers spaltning af myresyre i brint og kuldioxyd. Det fandtes, at nitrationer var at foretrække frem for nitritioner, og den optimale nitratkoncentration blev bestemt til 0,5 % NaNO₃. Endvidere er fundet, at flade Miller-Prickett-tubes med indlagt hvid emialjeglasplade letter tællingen af kolonier væsentligt. For at opnå veludviklede kolonier med en typisk præcipitatzone, blev mediets agarindhold reduceret til 0,9 %. To udsædsserier til sammenlignende colitælling i modificeret R.V.G.-nitriat-højagar kontra almindelig R.V.G.-agar i petriskåle ved såvel 37° som 44° C viste stort set ingen statistisk sikker forskel.

Ved dyrkning især fra rå mælk iagttoges i såvel højagarrørene som plademediet en del meget små og skarpt afgrænsede kolonier. 108 af disise stammer viste sig alle — med undtagelse af 2 — at kunne henføres til gruppen coliforme baktereir. Med henblik på undersøgelse af R.V.G.-agars selektive egenskaber er foretaget udsæd af en række non-coliforme mikroorganismer. Herved har kun nogle få streptokokstammer (tilhørende fæcalis-gruppen) samt Proteus, Alcaligenes og Pseudomonas vist sig i stand til at vokse i mediet, men i intet tilfælde med kolonier, der kunne forveksles med colikolonier.